I dipinti esposti in questa sala si scalano dalla signoria dei Bentivoglio (caduta nel 1506) fino alle soglie della riforma dei Carracci, coprendo quindi quasi tutto il XVI secolo e gli inizi del secolo successivo.
Al centro della sala è posta la Crocifissione, capolavoro giovanile di Francesco Francia, che rappresenta il passaggio dalla grande tradizione del Quattrocento ferrarese ad una nuova "dolcezza nei colori unita" introdotta in Italia da Francesco Francia e da Pietro Perugino, come afferma lo storiografo Giorgio Vasari a metà Cinquecento.
Alcuni dipinti, in cui prevale il tema della Madonna col Bambino, rappresentano i successivi sviluppi dell'arte bolognese, coi "raffaellisti" quali Innocenzo da Imola o Girolamo da Cotignola e soprattutto con l'eccentrico Amico Aspertini. Ai primi anni del Cinquecento appartengono anche due opere di Luca Signorelli da Cortona e di Filippo da Verona.
L'ambiente culturale manierista della seconda metà del secolo è rappresentato dal Crocifisso di Bartolomeo Passerotti, da Prospero Fontana, fino al grande affresco con La Concordia e il Silenzio, attribuito ad Orazio Samacchini, che proviene proprio da palazzo Comunale.
Fra i ritratti spicca quello bellissimo, di mano del Tintoretto. Il soffitto risale al momento dell'arrivo a Bologna dei Francesi guidati da Napoleone Bonaparte (1796-1797).
Mostra una decorazione di gusto francese attribuita al decoratore Serafino Barozzi (1735-1810) con simbologie "rivoluzionarie" (trofei, are, bandiere ecc.).
